脑利钠肽化学发光免疫分析方法检测试剂性能临床评价

【摘要】：目的 评价湖南乐准生物科技有限公司（以下简称乐准公司）的脑利钠肽（以下简称BNP）检测试剂（磁微粒化学发光法）的性能。方法 对检测试剂盒的空白限、检出限、线性范围、正确度、精密度、抗干扰性、与参比试剂的相关性及阴阳性符合率进行评价。结果 试剂盒空白限实测0.64 pg/ml，检出限5 pg/ml； 线性范围为5.0-5000.0 pg/ml，相关系数为 0.999；正确度参考品测试结果在靶值的95%置信区间之内；精密度小于10%；样本中血红蛋白<5.00 g/L，胆红素<0.2 g/L，甘油三酯<30.0 g/L，氨基末端脑利钠肽前体＜1000 pg/ml时，对本试剂的检测无显著影响。测试164人份的血浆标本，它与贝克曼-B型钠尿肽参比试剂比对结果相关性r=0.9841；经Bland-Altman分析，计算得到P=0.0125<0.05，两检测系统测量值有差异；阴阳性符合率统计显示阳性符合率100%，阴性符合率97.18%，总符合率98.78%。 结论 乐准生物公司脑利钠肽（BNP）试剂检测时间为15分钟，试剂的空白限、检出限、线性范围、正确度、精密度、抗干扰符合实验室质量标准要求；它与贝克曼-B型钠尿肽参比试剂相比，两系统检测结果相关性良好，但测量值有差异，样本阴阳性符合率一致，基本能够满足临床检测需求。

脑利钠肽是一种激素，可对血压进行调节。对人体来说，脑利钠肽主要由心脏产生，是随着心脏压力的增高而释放的。多项研究显示BNP测定项目在临床应用的范围较广，包括诊断、监测和预后[1-3]。BNP的循环水平随着左室功能下降和日趋严重的心衰临床症状而升高，进行BNP测定可诊断心衰 并根据NYHA的分级对其定级[4-6]。已有其他研究表明较高的BNP循环水平与心脏病发生率和心衰[7-8]及急性冠脉综合征[9]患者死亡率的升高有关，并认为可采用BNP作为患者预后的一项指标。因此，脑利钠肽是一个很好的反映心功能的指标，具有重要的病理生理学意义。

本试剂盒采用双抗体夹心化学发光免疫分析法与磁微粒分离技术相结合的检测方法。试剂中两种鼠抗BNP单克隆抗体分别被ALP、FITC标记，可与样本中的分析物反应形成ALP标记抗体-抗原-FITC标记抗体的双抗体夹心复合物，加入磁分离剂（含有与鼠抗FITC抗体结合的磁微粒）后，复合物与磁珠结合，然后加载磁场使复合物吸附在反应容器内，使用清洗液洗去游离酶标抗体，最后再加入发光底物，复合物中的ALP催化底物产生化学发光，其相对发光值（RLU）在一定范围内与复合物浓度成正比，根据校准曲线计算得出待测样本的BNP含量。

一、研究材料与方法

1.标本来源：测试使用的164份血浆标本均来自上海市同济医院。全血的抽取、血浆的分离以医院使用的标准方法进行采集。

2.仪器与试剂:（1）评价用试剂和部分样品为湖南乐准生物科技有限公司生产：脑利钠肽（BNP）测定试剂盒（磁微粒化学发光法），批号为20230823；BNP校准品，批号为20230217；BNP质控品，批号为20230217；BNP正确度参考品，批号为20230627；BNP空白限样品，批号为20230627；BNP检测限样品，批号为20230627；BNP线性样品，批号为20230627；BNP精密度样品，批号20230106。检测系统-全自动化学发光免疫分析仪-9000i，湖南乐准生物科技有限公司。（2）干扰物：血红蛋白，购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，批号SLCJ0443，胆红素，购自北京百灵威科技有限公司，批号L390S62；甘油三酯，购自费森尤斯卡比华瑞制药, 批号80NH005；氨基末端脑利钠肽前体(NT-proBNP)，购自海肽生物科技（上海）有限公司, 批号23/03-8NT2。（3）参比试剂：B型钠尿肽检测试剂盒（双抗夹心免疫酶法），Beckman Coulter公司，BNP Triag批号为338053。参比检测系统为贝克曼全自动化学发光免疫分析仪-UniCel DxI800。

二、评价方法

1.空白限：依据《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则（征求意见稿）》[10]验证空白限。用零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的RLU值（相对发光值），计算其平均值（`X）和标准差（SD），得出（`X ）+2SD，根据零浓度校准品和相邻校准品之间的浓度-化学发光（RLU）值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将（`X ）+2SD所对应的RLU值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为空白限。

2.检出限：依据《YY T 1451-2016脑利钠肽和氨基末端脑利钠肽前体检测试剂（盒）（定量标记免疫分析法）》[11]验证检出限。用乐准生物提供的5份浓度近似检出限（厂家说明书规定：5.00 pg/ml）的低值样本进行检测每份样本检测5次，对检测结果按照大小进行排序，低于空白限的检测结果（厂家技术要求规定：2.00 pg/ml）的数量应小于或等于3个。

3.线性范围：依据《YY T 1451-2016脑利钠肽和氨基末端脑利钠肽前体检测试剂（盒）（定量标记免疫分析法）》验证线性。将接近线性区间上限的高值样本和接近线性区间下限的低值样本按一定比例稀释为至少5种浓度，本次实验分别准备4.0 pg/ml、100.0 pg/ml、500.0 pg/ml、1250.0 pg/ml、2500.0 pg/ml、5000.0 pg/ml6种不同浓度样本，按试剂盒说明书进行操作，对每一浓度的样本均重复检测3次，计算其平均值。将结果平均值和理论浓度用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数|r|。

4.正确度实验方法：依据《WS_T 492-2016 临床检验定量测定项目精密度与正确度性能验证》[12] 验证正确度。用乐准生物提供的正确度参考品重复测定2次，连续测定5天，计算均值和标准差，以及置信区间帮助验证指定值，参考品的靶值均在95%置信区间和验证区间之内。

5.精密度实验方法：依据《WS_T 492-2016 临床检验定量测定项目精密度与正确度性能验证》验证精密度。乐准生物提供的BNP精密度样品，包含高、中、低值3个浓度水平，每个样品重复测定3次，连续测定5天，如果因为质量控制程序或者操作问题判断一批为失控，应剔除数据，并增加执行一个分析批。计算实验室内标准差和实验室变异系数，变异系数应小于10%。

6.干扰实验：依据《定量检测体外诊断试剂分析性能评估注册审查指导原则》[13]验证干扰。以厂家提供的血红蛋白、胆红素、甘油三酯、氨基末端脑利钠肽4个干扰物原液，分别取已有测值的高（2000-5000 pg/ml）、低（100-500 pg/ml）浓度血浆样本，每个水平血浆样本分别添加不同的干扰物原液制备对应的待测样本： 5.00g/L血红蛋白，0.2 g/L胆红素，30.0 g/L甘油三酯，1000 pg/ml氨基末端脑利钠肽前体4种干扰待测物样本，干扰前、干扰后各检测 3 次，取均值计算干扰率，判断本试剂盒的检测是否会受到以上4 种物质的干扰。

7.比对实验：依据《YY T 1451-2016脑利钠肽和氨基末端脑利钠肽前体检测试剂（盒）（定量标记免疫分析法）》和EP09-A2[14]进行样本比对评价，使用164份血浆标本，比对试剂与参比试剂采用盲法操作，操作步骤及方法严格按照各自的产品说明书要求进行。采用SPSS统计软件，对试验数据进行线性回归统计分析，计算相关系数R，判断检测结果是否线性相关；采用Medcale统计软件，对试验数据进行Bland-Altman分析，计算检测结果是否有差异；以100 pg/ml为阴阳性界定值，将实验数据进行阴阳性符合率统计，综合评价本试剂盒与贝克曼BNP产品的相关性和符合性。

三、结果与分析

1.空白限：空白限样品（即零浓度度校准液）重复测定20次，实验结果空白限为0.64 pg/ml，见表1。

表1 空白限

2.检出限：用乐准生物提供的5份浓度近似检出限（厂家说明书规定：5.00 pg/ml）的低值样本进行检测，结果表明，低于空白限（厂家技术要求规定：2.00 pg/ml）的检测结果的数量为零，见表2。 

表2 检出限

3.线性范围:在浓度为4.0~5000.0 pg/ml范围内，产品线性关系良好，回归方程分别为y = 1.04x - 4.3189，R = 0.9999，见图1。 

图1  线性相关图

4.正确度:用乐准生物提供的正确度参考品重复测定2次，连续测定5天，2个正确度参考品的靶值均在95%置信区间和验证区间之内，见表3-4。

表3正确度参考品1

表4正确度参考品2 

5.精密度:用乐准生物提供的BNP精密度样品重复测定3次，连续测定5天，3个不同浓度水平的BNP精密度样品的实验室变异系数均小于10%，见表5-7。 

表5精密度样品1

表6精密度样品2 

表7精密度样品3

6.干扰实验:每个浓度干扰物对结果的干扰率均小于15%，无显著性差异，见表8-9。

表8 低值样本干扰

表9高值样本干扰 

7.比对实验:（1）线性相关性结果：两种试剂共同对 164 份血浆样本分别检测，在检测范围5.0-5000.0 pg/ml，用 SPSS 软件统计。如图 2 所示，计算得到线性回归方程：y = 0.9895x + 33.566，R = 0.9841，相关系数 R=0.9841＞0.975，两种脑利钠肽（BNP）试剂检测结果线性相关。（2） 采用Medcale统计软件对两种试剂检测值进行Bland-Altman分析，计算得到P=0.0125<0.05，两试剂检测系统结果有显著差异，见图3。

图2 乐准血浆与贝克曼血浆比对线性相关图

图3  两种试剂测值的Bland-Altman图

（3）样本阴阳性一致率：164例血浆样本，以100 pg/ml为阴阳性界定值进行符合率统计，阳性符合率100%，阴性符合率97.18%，总符合率98.78%，见表10

表10 样本阴阳性符合率分析

（4）异常样本分析：本次评价过程中，本试剂与参比试剂出现4例样本测值异常，见表11，经过复测分析：参比试剂第1次测值呈阳性，第2次复测均为阴性；同样的4例样本，本试剂两次测试结果均为阴性。 

表11异常样本分析

四、结论 

乐准生物公司的脑利钠肽（BNP）检测试剂（磁微粒化学发光法），同时支持全血测试，检测时间为15分钟。检测空白限为0.64 pg/ml；检出限满足5 pg/ml；精密度评价变异系数小于10%；检测线性范围在5.0~5000.0 pg/ml，线性相关系数 R为0.9999，能够满足临床需要。使用血浆样本与贝克曼B型钠尿肽检测试剂盒（双抗夹心免疫酶法）比对结果显示相关系数为R= 0.9841，检测结果有良好的线性相关性。但是对两系统测量值进行Bland-Altman分析，计算得到P=0.0125<0.05，说明两系统测量值有差异，对经阴阳性符合率统计，结果显示阳性符合率100%，阴性符合率97.18%，总符合率98.78%，样本阴阳性有良好的一致性。评价过程中发现本试剂与参比试剂出现4例样本测值异常，贝克曼两次重复测试结果相反，需分析原因，乐准生物的两次测试结果一致。综上所述乐准生物公司的脑利钠肽（BNP）检测试剂基本满足临床质量要求。

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